17卷4期2001年7月

生 物 工 程 学 报

Chinese Journal o f Biotechnology V ol.17N o.4

July 2001

收稿日期:,修回日期:。

基金项目:国家自然科学基金资助()

3通讯作者。T el :1492;Fax :1492;E 2mail :x.zhang @ 张先恩

13

刘虹1 张成刚2 Anthony E G Cass

3

1(中国科学院武汉病毒研究所 武汉 )

2

(中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 )

3

(Biochemistry Department ,Im perial C ollege of Science ,T echnology M edicine ,London ,SW72AY,UK )

摘 要 将黑曲霉葡萄糖氧化酶(G OD )基因重组进大肠杆菌2酵母穿梭质粒pPIC9,转化甲基营养酵母Pichia pasto 2

ris G S115,构建出G OD 的高产酵母工程菌株。在酵母α2Factor 及AOX 1基因启动子和终止信号的调控下,黑曲霉

GOD 在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外,经甲醇诱导3~4d ,发酵液中的G OD 活力可达30~40u P m L 。S DS 2PAGE

证实G OD 在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白,约占胞外蛋白总量的60%~70%,经Q Sepharose T M

Fast Flow

离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母G OD 比活达u P mg 蛋白,是商品黑曲霉G OD 的116倍。动力学

性质分析表明,重组酵母G OD 的K m 和k cat 分别为mm ol P L 和s -1,与商品黑曲霉G OD 相比,具有更高的

催化效率。重组酵母G OD 的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。关键词 葡萄糖氧化酶,甲基酵母Pichia pastoris ,基因表达,纯化,动力学分析,生物传感器中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号(2001)

葡萄糖氧化酶(G lucose oxidase ,EC 1.1.3.4,简称G OD )消耗氧气催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯,并释放出H 2O 2,广泛应用于蛋白脱糖、食品除氧及葡萄糖定量分析等,也是迄今为止生物传感器领域最主要的工具酶。目前,G OD 的大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉菌发酵,但黑曲霉和青霉菌发酵生产G OD 过程中,过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂蛋白的存在给纯化带来相当的困难

。因

此,构建生产性能优良的G OD 产生菌,研制及生产高品质的G OD 制剂,具有重要意义。Frederick K R [2]

和Whittington H [3]

分别在酿酒酵母中表达了黑

曲霉和青霉菌的G OD 基因,获得了具有生物学活性的酿酒酵母G OD 。Witt S 等[1]

试图在大肠杆菌中表达G OD ,但活力较低。甲基营养酵母Pichia pastoris 表达系统为80~90年代发展起来的优良酵母表达系统

,已成功地表达了数十种相关蛋白。本文采

用Pichia pastoris G S115高效酵母表达载体,成功地构建了G OD 高产酵母工程菌株,实现了G OD 在甲基酵母中的高效表达和分泌,并对重组酵母G OD 和商品黑曲霉G OD 的性质进行了比较分析。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒:甲基营养酵母Pichia pastoris G S115和质粒pPIC9为中国科学院上海生命科学院

生物工程研究中心杨胜利教授馈赠。T 载体和黑曲霉9029分别购自Promega 公司和美国典型菌种保藏

中心(ATCC ),其余菌株和质粒为本室保存或本工作构建。E .coli DH5α作为受体菌用于质粒pPIC9、T 载体及它们衍生质粒的保存与扩增。

1.1.2 培养基:大肠杆菌的培养和转化用LB 培养

基。酵母的培养、转化和蛋白的诱导生成用Y PD 、M D 、M M 及RD 等培养基。

培养基组成成分如下:

LB (L -1

):蛋白胨10g ,酵母膏5g ,氯化钠10g ;Y PD (L -1

):蛋白胨20g ,酵母膏10g ,葡萄糖20g ;

MD (L

-1

):酵母基本氮源培养基(Y NB )117g ,硫

酸铵5g ,葡萄糖20g ,生物素400μg ;

MM (L -1

):Y NB117g ,硫酸铵5g ,甲醇12m L ,生物素400μg ,酪蛋白水解物10g ,pH516;

RD(L-1):Y NB117g,硫酸铵5g,葡萄糖20g,生物素400μg,琼脂粉30g,山梨醇g。

1.1.3 试剂:限制酶、DNA聚合酶和T4DNA连接酶为T aK aRa和Sang on公司产品;酵母裂解酶、邻联茴香胺、G OD、牛血清白蛋白(BS A)等购自Sigma公司;蛋白质浓度测定试剂盒为Bio2Rad公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 黑曲霉基因组的提取:黑曲霉基因组的制备采用氯化苄法[5]。将黑曲霉在26℃条件下培养2d,离心收集菌体,并将菌体依次用10m L水和10m L提取液(100mm ol P L Tris2HCl,40mm ol P L E DT A,pH815)各洗涤1次。加入10m L提取液重悬菌体,再加入2m L 10%S DS、6m L氯化苄,剧烈振荡混匀,使管内混合物呈乳状。将该混合物于50℃保温1h,每隔10min振荡混合1次,然后加入6m L3m ol P L醋酸钠,冰水浴15min。4℃、6000r P min离心15min,取上清,加入等体积的异丙醇沉淀黑曲霉基因组DNA。

1.2.2 酵母的转化和基因组的提取:酵母的转化采用原生质体转化法[6]。G S115于Y PD中培养至OD600=012,离心收集细胞。依次用10m L水洗1次、10m L SE D(1m ol P L山梨醇,25mm ol P L E DT A, 50mm ol P L DTT)洗1次、10m L1m ol P L山梨醇洗2次细胞,重悬细胞于10m L SPE缓冲液(1m ol P L山梨醇, 10mm ol P L E DT A,011m ol P L磷酸钾缓冲液,pH715),加入512mg P m L的酵母裂解酶20μL,在30℃下缓慢摇动至镜检80%~90%酵母细胞形成原生质体。依次用10m L1m ol P L山梨醇洗2次、10m L CaS(10mm ol P L CaCl2,1m ol P L山梨醇)洗1次原生质体,然后重悬原生质体于016m L CaS中。100μL原生质体与4μg 线性化质粒DNA(StuⅠ切)、20μg鲑鱼精担体DNA 混合,室温下放置20min。加入1m L20%聚乙二醇3350(10mm ol P L CaCl2,10mm ol P L Tris2HCl,pH714),继续放置15min,离心收集原生质体。将原生质体重悬于150μL S OS(1m ol P L山梨醇,10mm ol P L CaCl

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